Crecimiento Bacteriano

Puede ser definido como el aumento ordenado de todos los constituyentes químicos de la célula. Las condiciones físicas y químicas del medio donde el microorganismo se encuentra afectan marcadamente sus actividades. La comprensión de como influye el ambiente sobre el crecimiento nos ayuda a explicar la distribución de los microorganismos en la naturaleza y hace posible diseñar estrategias que favorezcan el crecimiento o que nos permita controlarlo. Las bacterias como grupo, son extremadamente versátiles y tienen gran capacidad para utilizar una amplia gama de nutrientes que van desde compuestos inorgánicos simples, a compuestos

orgánicos más complejos. Los nutrientes se pueden dividir en dos clases: esenciales, sin los cuales la célula no puede crecer y no esenciales, se usan cuando están presentes pero no son indispensables. Algunos nutrientes son usados solo como precursores de macromoléculas celulares, otros solo como fuente de energía sin ser incorporados directamente al material celular y otros cumplen las dos funciones al mismo tiempo. También se pueden clasificar como macro y micronutrientes según la cantidad requerida. 

Macronutrientes

 El carbono es el mayor constituyente de la célula bacteriana, por lo tanto no llama la atención que requiera más carbono que cualquier otro nutriente. Según la forma en que lo usa, existen fundamentalmente dos tipos de bacterias: autótrofas y heterótrofas. Las primeras son capaces de sintetizar todos sus componentes orgánicos a partir de compuestos inorgánicos como el CO2 . Como ejemplo de este grupo citamos las bacterias del suelo, que carecen de interés médico. En cambio, las heterótrofas usan sustancias orgánicas como fuente de carbono. En este grupo se encuentran todas las bacterias de interés médico. La glucosa, por ejemplo, es usada como fuente de carbono y de energía. También existen bacterias que pueden usar otras sustancias orgánicas como fuente parcial o exclusiva de carbono. Entre las bacterias más versátiles se encuentran las del género Pseudomonas, muchas de las cuales pueden usar más de cien compuestos orgánicos. Después del carbono, el elemento más abundante en la célula es el nitrógeno que representa entre el 12 y el 15% del peso seco. Es el constituyente principal de las proteínas y los ácidos nucleicos. La mayoría de las bacterias son capaces de usar el amonio como fuente de nitrógeno, mientras que otras pueden usar los nitratos. La reducción de nitratos, se puede lograr por dos mecanismos diferentes: reducción asimiladora, en la cual se reduce por la vía del nitrito y reducción desasimiladora, donde el nitrato sirve como aceptor final de electrones. La primera está bastante extendida entre las bacterias, mientras que la segunda solo es común en bacterias anaerobias y anaerobias facultativas. El fósforo es usado para la síntesis de ácidos nucleicos y de fosfolípidos. La mayoría de las bacterias lo usan en forma inorgánica como fosfato (PO4=). Los fosfatos orgánicos si bien están distribuidos ampliamente en la naturaleza, para ser usados deben ser atacados primero por fosfatasas, enzimas que clivan estos compuestos liberando el fósforo inorgánico. 

Micronutrientes

 Aunque requeridos en cantidades muy pequeñas, los micronutrientes son importantes para la nutrición de la bacteria. Entre estos destacamos el cobalto, el cobre y el manganeso.

Factores de Crecimiento

Son sustancias que deben ser aportadas preformadas, porque la bacteria que los requieren no pueden sintetizarlos a partir de los nutrientes ya sea por falla o ausencia de una vía metabólica determinada. Estas sustancias incluyen vitaminas del complejo B, aminoácidos, purinas y pirimidinas. Las bacterias que no necesitan factores de crecimiento, se denominan prototróficas y, las que sí los requieren, auxotróficas para ese factor.

Requerimientos Atmosféricos y Ambientales.

•  Oxígeno Las exigencias de oxígeno de una bacteria en particular, reflejan el tipo de metabolismo productor de energía. Según su relación con el oxígeno, existen bacterias: anaerobias obligadas, anaerobias facultativas, aerobias obligadas y microaerófilas. De las primeras (anaerobias obligadas), existen las estrictas y las aerotolerantes. Las bacterias anaerobias obligadas estrictas, crecen en ausencia de oxígeno, el cual es muy tóxico e incluso letal cuando la exposición es breve. Las segundas (aerotolerantes) también crecen solo en ausencia de oxígeno, pero toleran su presencia un poco más que las anteriores; por ejemplo: Clostridium sp. Las bacterias anaerobias facultativas, son capaces de crecer en presencia o en ausencia de oxígeno. Ejemplo de éstas son las bacterias de la familia Enterobacteriaceae. Las aerobias obligadas, requieren oxígeno para su desarrollo. Dentro de este grupo se encuentran la Pseudomonas. Por último, las microaerófilas crecen mejor con presiones de oxígeno bajas (3 a 5%); las concentraciones altas (21%) inhiben su crecimiento. En las bacterias aerobias, anaerobias facultativas y anaerobias aerotolerantes, la enzima superoxidodismutasa impide la acumulación del radical superóxido; esta enzima está ausente en los anaerobios estrictos. El peróxido de hidrógeno formado por la acción de la superoxidodismutasa es destruido con rapidez por la enzima catalasa o peroxidasa, como ya se mencionó. En el laboratorio de microbiología los requerimientos atmosféricos de oxígeno, pueden determinarse cultivando la cepa en caldo tioglicolato. Este medio contiene muchos nutrientes, siendo un caldo de enriquecimiento apropiado para casi todas las bacterias de interés médico. El ácido tioglicólico actúa como agente reductor que disminuye el potencial redox del medio, generando un gradiente de concentración de oxígeno a lo largo del tubo. En la superficie del medio, la concentración es similar a la atmosférica y va disminuyendo gradualmente hasta que en el fondo del tubo no existe oxígeno disuelto. Las bacterias aerobias estrictas podrán crecer en la superficie del caldo, las microaerófilas crecerán en la franja inmediata que está debajo de la superficie. Las anaerobias facultativas crecerán en todo el tubo, mientras que las anaerobias lo harán en el fondo del mismo. 
• Anhídrido carbónico Algunas bacterias como Neisseria y la Brucella, tienen muchas enzimas con baja afinidad por el CO2 y requieren una concentración más elevada (10%) de la que habitualmente está presente en la atmósfera (0.03%). Estos requerimientos atmosféricos mencionados deben ser tenidos en cuenta cuando se realiza el cultivo de estas bacterias. 
• Potencial de oxidación reducción Es un requerimiento físico del medio de cultivo. Éste es un factor crítico para determinar si se desarrollará o no el inoculo sembrado en dicho medio. Para la mayoría de los medios de cultivo en contacto con el aire, el potencial de oxidación reducción es de +0,2 a +0,4V, a pH 7. Las bacterias anaerobias obligadas son incapaces de crecer a menos que el potencial sea tan bajo como -0,2V. Para establecer dichas condiciones en un medio de cultivo se puede eliminar el oxígeno, recurriendo a sistemas de cultivo anaerobio o agregando al propio medio compuestos que contengan sulfidrilo, por ejemplo el tioglicolato de sodio. 
• Temperatura Es uno de los factores ambientales más importantes que influyen en la proliferación y mantenimiento de la vitalidad de los microorganismos. Cada bacteria tiene su propia temperatura mínima por debajo de la cual no puede proliferar, temperatura óptima en la cual el crecimiento es mas rápido y temperatura máxima por encima de la cual no puede multiplicarse. Así, es posible distinguir tres grupos de microorganismos según el rango de temperatura en el que es posible su multiplicación: psicrófilas, crecen entre -5 y 30ºC, temperatura óptimo de 15ºC; mesófilas, crece entre 10 y 45ºC, con el óptimo a los 30ºC y termófilas, que crecen entre 25 y 80ºC, con el óptimo en 55ºC. En el laboratorio se puede determinar la temperatura óptima de crecimiento, sembrando el microorganismo en estudio en un medio de cultivo adecuado e incubándolo a diferentes temperaturas, para después evaluar los rendimientos obtenidos en las distintas condiciones. Si bien la mayoría de los microorganismos de interés medico son mesófilos, pueden existir diferencias entre las temperaturas de crecimiento óptimas de los mismos, siendo para la mayoría de 35 a 37ºC.
•  Concentraciones de hidrógeno Cada microorganismo tiene un rango de pH en cual puede crecer y un pH óptimo bien definido. Según en el pH que se obtenga mayor rendimiento, encontramos microorganismos acidófilos, neutrófilos (la mayoría de interés médico) y alcalófilos, que crecen bien en pH ácidos, neutros y alcalinos respectivamente. Para la mayoría de las bacterias de interés médico, el pH óptimo es de 7,2 a 7,6. Sin embargo, hay microorganismos humanos como M. tuberculosis que resisten valores muy bajos de pH. Como los microorganismos al multiplicarse y realizar sus funciones metabólicas, suelen modificar el pH del medio, éste puede prepararse con amortiguadores de pH (buffer), los cuales mantiene el pH relativamente constante. 
• Condiciones osmóticas y disponibilidad de agua El agua es un requerimiento esencial para todo ser vivo y la disponibilidad de ésta es un factor importante que afecta el crecimiento de los microorganismos en sus ambientes naturales. Esta disponibilidad no depende solamente del contenido de agua que haya en el ambiente, porque algunas sustancias y superficies pueden absorber moléculas de agua y por consiguiente reducir la disponibilidad en el ambiente. Las sales y los azúcares disueltos en agua, condicionan la disponibilidad de la misma porque las moléculas de agua se asocian y no quedan disponibles para ser usadas por los microorganismos. La disponibilidad de agua se expresa generalmente como actividad acuosa o potencial de agua. Generalmente los microorganismos se encuentran en ambientes con menor cantidad de solutos que en el interior celular, por lo tanto el agua tiende a entrar a la célula por osmosis. Por el contrario, si se encuentran en medios de baja actividad acuosa, el agua tenderá a salir de la célula, por lo tanto perderá agua. Así, encontramos microorganismos que pueden crecer en altas concentraciones salinas (halófilos) como las que están en el agua de mar, en altas concentraciones de azúcar (osmófilos) como las que hay en una jalea o en ambientes muy secos (xerófilos). Estos generalmente captan agua de dichos ambientes, gracias a las altas concentraciones de solutos en su interior. La concentración de solutos con actividad osmótica dentro de la célula bacteriana es superior a la concentración del exterior celular. Con excepción de las bacterias del género Mycoplasma y de las formas lister (L) que no tienen pared celular, la mayoría de las bacterias tienen tolerancia osmótica que les permite soportar grandes cambios de osmolaridad.
• Captación de nutrientes La concentración de solutos en el interior de una célula bacteriana es mayor que en el medio extracelular. Esto es aplicable tanto al medio natural como a la mayoría de los medios de cultivo usados en el laboratorio. La principal barrera para el paso de solutos entre la célula y el medio externo es la membrana celular. Las bacterias están rodeadas de membranas semipermeables, compuestas por una mezcla compleja de proteínas, lípidos y glucoproteínas, que restringen el ingreso de la mayoría de los solutos. Sin embargo, tienen sistemas que permiten el transporte de sustancias pequeñas a través de dichas membranas. Las moléculas de mayor tamaño primero deben ser degradadas a moléculas más pequeñas por enzimas (exoenzimas) producidas por la propia bacteria y secretadas al exterior celular. En las bacterias gramnegativas estas exoenzimas se encuentran fundamentalmente en el espacio periplásmico (espacio virtual ubicado entre la membrana externa y la membrana plasmática), mientras que en las bacterias grampositivas están ancladas en la membrana plasmática. Dichas enzimas son activas sobre: proteínas, polisacáridos, lípidos y ácidos nucleicos, entre otros. Bacterias como S. aureus, S. pyogenes, y C. perfringens, elaboran algunas de estas enzimas que contribuyen a la virulencia, destruyendo los componentes vitales de los tejidos del huésped infectado. Pueden ser constitutivas (se sintetizan siempre) o inducibles (se sintetizan solo cuando está presente su substrato). Con excepción del agua y el amonio que ingresan a la célula por difusión pasiva en respuesta a un gradiente de concentración a ambos lados de la membrana, el resto de los metabolitos lo hacen por sistemas de transporte más específicos. Tanto las porinas, como los canales de maltosa, no requieren consumo de energía. Los primeros son sistemas inespecíficos que permiten el ingreso de moléculas pequeñas (peso molecular menor o igual a seis mil dalton). Las porinas son proteínas ubicadas en la membrana externa de las bacterias gramnegativas, que forman canales o poros permitiendo el pasaje de las moléculas pequeñas e hidrofílicas. En la difusión facilitada, una proteína asociada a la membrana celular facilita el equilibrio a ambos lados de la misma, actuando en conjunto con una quinasa citoplasmática dependiente de ATP. Estas proteínas de membrana se denominan permeasas y muchas son inducidas por el substrato a ser transportado. Cuando la sustancia es fosforilada por la quinasa citoplasmática, queda atrapada dentro de la célula. La difusión facilitada se parece a la difusión simple, porque el substrato se mueve por un gradiente de concentración (de mayor a menor), por lo tanto el propio proceso de transporte no requiere energía. La diferencia que tiene con la difusión pasiva, es que está mediada por una proteína transportadora, es más rápida y tiene mayor especificidad de substrato. El transporte activo permite que los solutos ingresen a la célula en contra de un gradiente de concentración, consumiendo energía metabólica. Como ejemplo citaremos al sistema de la ß-galactósido permeasa, mediante el cual la lactosa (disacárido) es concentrado dentro de una bacteria como E. coli. El transporte de la lactosa se produce por una permeasa específica (proteína M); dicha reacción implica gasto de energía. La energía se usa para disminuir la afinidad de la permeasa por la lactosa en la parte interna de la membrana celular, favoreciendo su rápida liberación dentro del citoplasma. Si la generación de energía es bloqueada por el agregado de azida de sodio al sistema, la permeasa cataliza la difusión facilitada de la lactosa, cesando el transporte cuando la concentración del disacárido sea la misma a ambos lados de la membrana. En medios aerobios y a pH neutro, la baja concentración de hierro no permite alcanzar un desarrollo óptimo. Las bacterias han desarrollado varios sistemas para obtener cantidades adecuadas de dicho elemento. Los sideróforos son ligandos de bajo peso molecular cuya función es suministrar hierro a la célula. Aunque existe una variación importante en la estructura delos distintos tipos de sideróforos conocidos, la mayoría son de dos tipos: catecoles: la enterobactina es la más estudiada; e hidroximatos: producidos por algunos hongos. La enterobactina es un poderoso quelante que E. coli produce rápidamente cuando existe déficit de hierro y la secreta al medio externo. 

Crecimiento de las poblaciones bacterianas

El paso esencial para iniciar el estudio de una cepa bacteriana, es el cultivo. Este paso es importante para proveer de una población de bacterias que puedan ser analizadas mediante pruebas bioquímicas, serológicas, genéticas y de susceptibilidad a los antibióticos. El cultivo es el proceso de propagación de los microorganismos en el laboratorio, que se obtiene aportando las condiciones ambientales adecuadas y los nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano. Debemos recordar que algunas de las bacterias que causan infecciones en seres humanos no son capaces de crecer en medios artificiales inertes. Es necesario conocer cuales son los requisitos básicos de la bacteria en cuestión para su cultivo en el laboratorio (nutrientes, requerimientos atmosféricos y ambientales), así como los requisitos del o de los tipos bacterianos que se necesite recuperar. La siembra de un material que contiene bacterias en un medio sólido adecuado con la técnica de aislamiento permite, luego de un período adecuado de incubación, la recuperación de millones de bacterias agrupadas en colonias aisladas. Éstas pueden ser aisladas nuevamente en un nuevo medio para obtener un cultivo puro. El crecimiento se define como el aumento del número de bacterias en una población determinada

Es importante diferenciar entre el crecimiento de una célula individual y el de una población. Dicho crecimiento celular es el resultado del aumento del tamaño de la célula, seguido de su división. El crecimiento de una población, en cambio, es el resultado del aumento del número total de células, que puede ser cuantificado directamente (contando el número de células) o indirectamente (por ejemplo, midiendo la masa celular). El recuento de células totales puede determinarse por recuento microscópico en una cámara con áreas de volumen conocido, contando las células por unidades. Este recuento, considera la totalidad de las células presentes en la muestra (viables y no viables). Para realizar un recuento de las células viables, es necesario hacer un cultivo en medio sólido para contar el número de unidades formadoras de colonias (UFC) presentes en un volumen conocido de la muestra. Dicha técnica puede realizarse por siembra en la superficie de un medio apropiado o por siembra incorporada en agar. El crecimiento de las poblaciones bacterianas en un sistema de cultivo cerrado (sin entrada ni salida de los componentes del sistema), está limitado por el agotamiento de los nutrientes o bien por la acumulación de productos tóxicos del metabolismo. Cuando las bacterias se siembran en el laboratorio en un medio líquido (por ejemplo en un tubo de ensayo), se trata de un sistema cerrado de cultivo. Si se toman muestras a intervalos regulares en diferentes tiempos de incubación y se realiza un recuento del número de células viables por mililitro de cultivo, la representación gráfica de los datos (conteo de células viables en función del tiempo) dará la curva de crecimiento característica que consta de cuatro fases: latencia, exponencial, estacionaria y muerte.

Fase de Latencia

Las bacterias transferidas de un cultivo en fase estacionaria a un medio fresco, sufren un cambio en su composición química antes de ser capaces de iniciar la multiplicación. Hay aumento de los componentes macromoleculares y de la actividad metabólica, casi sin división celular, asociado a un incremento de la susceptibilidad a los agentes físicos y químicos. Por lo tanto, la mal llamada fase de latencia implica intensa actividad metabólica. 

Fase Exponencial

Las células se dividen a velocidad constante, determinada por la naturaleza intrínseca de la bacteria y por las condiciones del medio. Existe gran aumento del número total de células viables, que puede ser expresado en forma exponencial. Próximo al final de esta fase, se produce la liberación de exotoxinas por las bacterias que las producen.

Fase Estacionaria

Eventualmente el agotamiento de los nutrientes o la acumulación de productos tóxicos determina el cese del crecimiento. Hay pérdida de células por muerte, la cual es balanceada por la formación de nuevas células. Cuando esto ocurre, el conteo total de células aumenta levemente aunque el de las bacterias viables permanece constante. Hacia el final de esta etapa, puede ocurrir la esporulación en aquellas bacterias que poseen este mecanismo de resistencia. 

Fase de Muerte

Luego de la fase estacionaria, la tasa de muerte se incrementa, el número de bacterias viables disminuye rápidamente y, por lo tanto la curva de crecimiento declina. Las características de la curva de crecimiento pueden variar, dependiendo de las características propias del microorganismo, del estado metabólico del inoculo, del medio de cultivo y de las condiciones de incubación. Las condiciones físicas y químicas del medio donde el microorganismo crece afectan las actividades de éstos. La comprensión de cómo influye el ambiente en el crecimiento, nos ayuda a explicar la distribución de los microorganismos en la naturaleza y hace posible diseñar métodos que permitan estudiar y controlar el crecimiento bacteriano. Además, existen sistemas de cultivo abiertos que son poco usados en el laboratorio de microbiología clínica. El cultivo continuo (con aporte y salida de nutrientes y requerimientos a una tasa constante), permite mantener a las bacterias en una misma fase de crecimiento durante un largo período de tiempo (por ejemplo en la fase estacionaria o en la exponencial). Dicha técnica es interesante por ejemplo para los procesos productivos.